Structural and functional characterization of chaperones involved in the solubilization of protein aggregates : the role of CHIP from "Sorghum bicolor" and HspB1 in the human disaggregation system

Orientador: Carlos Henrique Inácio RamosTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A regulação da homeostase celular realizada pelo sistema de controle de qualidade proteico (PQC) é muito complexa e depende da ação de múltiplos processos orquestrados tanto pelas chaperonas moleculares quando pelo sistema ubiquitina-proteosomo. Em condições metabólicas normais, mas principalmente em situações de estresse celular, é extremamente importante que todos esses processos ocorram eficientemente, evitando assim o acúmulo de proteínas não funcionais que podem gerar graves consequências para as células. Desse modo, o estudo estrutural e funcional das proteínas que compõem o sistema PQC torna-se bastante relevante por produzir conhecimento com alto potencial de gerar inovações terapêuticas e biotecnológicas. Neste trabalho, conduzimos nossos estudos para a compreensão de duas proteínas muito importantes, cujas funções estão diretamente relacionadas com o direcionamento do destino de substratos proteicos. Primeiramente, o objeto de investigação foi a co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP). Assim, sua sequência gênica foi identificada através da homologia com o ortólogo de Arabidopsis, clonada e utilizada para superexpressão em E. coli. Após o estabelecimento de um protocolo de purificação, alguns parâmetros conformacionais foram determinados. Nossos resultados indicam que essa co-chaperona é um dímero alongado em solução, com estrutura rica em hélices-alfa e relativamente bem estável em situações de estresse térmico. Além disso, caracterizamos a formação de complexos entre ela e a chaperona Hsc70 e avaliamos sua atividade de auto-ubiquitinação e de ubiquitinação de outros substratos proteicos. Outro alvo de investigação foi o papel da sHsp HspB1 no sistema humano de desagregação de proteínas. Os resultados obtidos apoiam um modelo que explica o mecanismo de desagregação no qual HspB1 ativada por fosforilação é responsável por co-agregar com polipeptídeos desenovelados durante estresse térmico. Quando isso ocorre, o sistema da Hsp70, formado por Hsp70, Hsp40 e Hsp110, é capaz de extrair peptídeos dos agregados e também promover a dissociação de HspB1 em dímeros, sendo que esse processo permite uma desagregação mais eficiente. Mostramos que a fosforilação de HspB1 é importante para ativação da proteína, desestabilização dos oligômeros, mas não para a formação imediata de dímeros, a qual ocorre durante o processo de desagregação, por estimulação das chaperonas. Os dímeros de HspB1 se reorganizam espontaneamente em oligômeros permitindo o recomeço do ciclo para uma nova rodada de desagregação, exceto para o mutante GPG onde a desestabilização foi forçada artificialmente. De maneira geral, acreditamos que nossos resultados contribuem para o melhor entendimento da relação entre estrutura e função de CHIP de uma planta e fornecem informação para a compreensão do mecanismo de solubilização de agregados em células humanasAbstract: The maintenance of cellular homeostasis by the protein quality control (PQC) system is very complex and relies on multiple processes governed by molecular chaperones and ubiquitin-proteasome system. During normal metabolic conditions, but especially during stress conditions, it is extremely important that all these processes occur efficiently in the cell, avoiding the deposition of non-functional polypeptides which may cause damage. Therefore, the investigation of structural and functional aspects of proteins that belong to PQC system is quite relevant to gain information to terapheutic and biotechnology innovation. Thus, in this work, we aim to understand two very important proteins, whose functions are directly related to protein triage decisions in the cell. First, we investigate details about the co-chaperone CHIP from Sorghum bicolor (SBCHIP) and report on the sequence of the gene of interest identified through homology with the ortholog present in Arabidopsis. Additionally, the gene was cloned, used for superexpression in E. coli and the protein was purified and characterized as a dimer, rich in alpha-helix secondary structure and stable under thermal stress conditions. We also characterized the assembly of SbCHIP and HsHsc70 in complexes and evaluated SbCHIP activity of auto-ubiquitination and ubiquitination of other protein substrates. In addition, our research focus was on the role of the human HspB1 in the protein disaggregation activity of Hsp70 system. Taken together, our results support a model of disaggregation in which unfolded polypeptide co-aggregates with oligomers of activated HspB1. Hsp70 and co-chaperones (Hsp40 and Hsp110) extract the substrate from the aggregates, but also help to disassemble HspB1 into dimers, and this is required for efficient disaggregation. Activation of HspB1 by phosphorylation is important to destabilize oligomers, but not for the immediate formation of dimers. We propose that after disassembly aided by chaperones, HspB1 dimers reassemble spontaneously into oligomers, which allows the cycle to restart for a new round of disaggregation, except for the GPG mutant. In conclusion, the data presented here provides a better understanding of the relationship between structure and function of CHIP from a plant and also contributes to the understanding of the mechanism of solubilization of protein aggegates in human cellsDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular2014/00076-0, 2016/03764-0FAPES